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                    Multitron CHO 細胞培養

                    導語:搖瓶的使用對動物細胞的培養越來越重要。以下各種搖瓶中培養CHO(中國倉鼠卵巢)細胞的示例表明,Multitron細胞培養搖床(INFORS HT,CH Bottmingen)非常適合種子液的生產。

                    1. 簡介
                    搖瓶的使用對動物細胞的培養越來越重要。以下各種搖瓶中培養CHO(中國倉鼠卵巢)細胞的示例表明,Multitron細胞培養搖床(INFORS HT,CH Bottmingen)非常適合種子液的生產。

                    CHO細胞系是生物技術中常用的細胞系。為了生產用于接種的種子培養液和生產SEAP蛋白,使用了CHO-XM-111細胞株。瑞士蘇黎世聯邦理工學院 M.Fussengerger 教授的團隊用編碼重組蛋白SEAP(分泌型堿性磷酸酶)基因的表達載體轉染該細胞株,并使用由四環素控制的啟動子PhCMV-1。表達載體的使用使得通過啟動子可選擇性表達兩個基因成為可能。這樣就可以生產SEAP蛋白,包括非生產性的生長階段,和基于無四環素培養基交換的增殖抑制生產階段。

                    2. Multitron 技術參數
                    *  50 mm 振幅 (可選25mm)
                    *  通氣 空氣和  CO2 (0 – 20% asstandard)
                    *  蒸汽濕度套件(可選)
                    *  不同可選托盤 (一次培養袋托盤, 粘性托盤,通用托盤等)
                    *  其他選項 (制冷, 去污, ShakerBag等)

                    3. 實驗條件
                    為了在生物反應器中生產種子培養液(作為后期培養的接種物)和SEAP,使用CHO-XM-111細胞系,無血清和無蛋白的HP-1培養基(Cell Culture Technologies GmbH)在250 mL、500 mL和1000mL搖瓶中進行培養。在培養基中添加2g/L Pluronic F-68(Sigma)和2.5 mg/L 四環素(Sigma)。設置溫度37℃,濕度85% 和5%的CO2飽和度。所有搖瓶以恒定的122 rpm轉速在Multitron(INFORS-HT, CH-Bottmingen)中培養。

                    4. 批次補料振蕩培養
                    采用不同體積的搖瓶和相應的補料策略。

                    a) 在250ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行:

                    天/小時 – 步驟

                    體積(mL)

                    每毫升細胞濃度

                    存活百分比

                    0 d/0 h – 接種

                    50

                    3.0 x 105

                    86.9

                    1 d/21 h – 補料

                    50 (+ 30 mL)

                    6.6 x 105

                    91

                    2 d/43 h

                    80 (max. 32%)

                    1.95 x 106

                    97.4

                    3 d/67 h

                    80

                    2.25 x 106

                    98.3

                    4 d/91 h

                    80

                    1.95 x 106

                    98.7

                    Z大比生長速率μmax為0.048 h-1,倍增時間td =14.4h。

                    圖1: Multitron

                    b) 在500ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行:

                    天/小時 – 步驟

                    體積(mL)

                    每毫升細胞濃度

                    存活百分比

                    0 d/0 h – 接種

                    100

                    7.8 x 105

                    95.5

                    1 d/24 h – 補料

                    100 (+ 50 mL)

                    1.88 x 106

                    98.7

                    2 d/47 h – 補料

                    150 (+ 50 mL)

                    2.18 x 106

                    99.1

                    3 d/67 h – 更換培養基

                    250 (+ 50 mL)

                    2.33 x 106

                    99.3

                    4 d/91 h

                    300 (max. 60%)

                    2.63 x 106

                    99.7

                    5 d/115 h

                    300

                    4.65 x 106

                    99.4

                    6 d/139 h

                    300

                    3.90 x 106

                    98.1

                    7 d/163 h

                    300

                    2.55 x 106

                    81.8

                    Z大比生長速率μmax為0.024 h-1,倍增時間td =28.9h。

                    c) 在1000ml搖瓶中的培養過程按照以下模式進行:

                    天/小時 – 步驟

                    體積(mL)

                    每毫升細胞濃度

                    存活百分比

                    0 d/0 h – 接種

                    150

                    6.6 x 105

                    98.9

                    1 d/23 h – 補料

                    150 (+ 50 mL)

                    9.6 x 105

                    98.9

                    2 d/45 h – 補料

                    200 (+ 50 mL)

                    1.95 x 106

                    99

                    3 d/66 h – 補料

                    250 (+ 50 mL)

                    1.10 x 106

                    99.3

                    4 d/93 h

                    300

                    2.18 x 106

                    99.4

                    5 d/117 h –   15-fold dilution

                    400 (max. 40%)

                    2.25 x 106

                    98.5

                    8 d/189 h

                    400

                    1.40 x 106

                    66.9

                    Z大比生長速率μmax為0.044 h-1,倍增時間td =15.65h。

                    d) 蒸汽加濕
                    為了檢測每日液體損失,使用125 mL搖瓶,工作體積為15 mL、20 mL和25 mL,在溫度為37°C,濕度為85% rH的培養前后測定總體積。

                    5. 分析
                    a)  參數分析

                    每天使用細胞計數器yc100(Chemotec)測定活細胞濃度。使用Bioprofile Analyzer 100 Plus(Nova Biomedical)完成生長和生產基質的分析

                    b)公式                                                                                                                   
                    對于Z大生長速率μmax和倍增時間td的計算,使用以下公式。

                    6. 結果分析
                    為了優化CHO種子液培養,在Multitron細胞培養搖床中設置了三個不同體積的搖瓶(250ml、500ml和1000ml)。在培養CHO-XM-111細胞的同時,每天取樣檢測,從而可以**地比較細胞濃度、底物消耗和緩沖液。

                    對比Z大細胞濃度表明,500ml 搖瓶中的培養物每毫升可產生4.65×106個細胞。在所有培養物中,6天內可達到98%以上的存活率。通過優化補料策略,種子培養可在2天后進行,Z多5天(圖2)。



                    圖2:對比細胞濃度和活力

                    葡萄糖和谷氨酰胺的消耗量,尤其在500mL搖瓶中,表明底物在第五天之前是足夠的,因此補料可防止底物限制(圖3).



                    圖3:對比葡萄糖和谷氨酰胺


                    已知同時形成銨,乳酸和谷氨酸可降低細胞生長速率。在所有培養物中,在培養的第五天也觀察到亞臨界濃度的銨。此外,通氣和連續供應5%的CO?可以為培養系統提供**緩沖,因此也可以提供合適的pH條件(圖4)。



                    圖4:比較銨的含量,谷氨酸鹽,乳酸和pH


                    直接蒸汽加濕對培養基損失有重要影響,同時也會改變滲透壓。
                    特別是在小工作體積下,一天的Z大蒸發量小于0.4%。



                    圖5:125mL揮發量

                    搖瓶的工作體積對氧交換有很大影響,不應超過搖瓶Z適工作體積。

                    7. 總結

                    培養2-5天后,細胞總數達到1.8 x 10?和1.4 x 10?之間。它可用作2.5L生物反應器的接種物,活細胞濃度約為每毫升5×10?。
                    接種細胞密度和細胞活力越高,培養過程中細胞密度越高。
                    **盡早更換培養基
                    在較小接種量和**補料策略允許的情況下,可額外補充細胞培養營養物質。另一方面,培養液被稀釋,因此有毒產物減少。
                    在85%相對濕度條件下,蒸發量小于0.5%,可實現穩定的滲透壓和工藝再現性。

                    搖瓶培養可用于進一步的工藝步驟,例如接種生物反應器或一次性袋。

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