應用案例

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                    培養細胞中的線粒體提取

                    導語:分離線粒體的原理:從組織或細胞中分離線粒體的關鍵步驟,大致相同

                    ——使用杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

                    本文僅用于研究用途

                    一、介紹

                        分離線粒體的原理:從組織或細胞中分離線粒體的關鍵步驟,大致相同:(1)通過機械和/或化學手段使細胞破裂,(2)低速離心以除去雜質和較大的細胞器,隨后以較高的速度離心,以分離收集的線粒體。 此種線粒體分離方法可以滿足大多數應用。 下述步驟詳述提取步驟,旨在提供能夠獲得盡可能高產量和酶活性的線粒體。

                    二、實驗方案(詳見6操作步驟)

                    1、凍融法弱化細胞膜,以5.0mg / ml懸浮于試劑A中,置于冰上10分鐘。

                    2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 勻漿,損壞細胞膜

                    3、SPIN 1: 4°C溫度下1000g離心力,離心10分鐘,收集上清液#1. 重復收集上清液#2

                    4、SPIN 2: 4°C溫度下12,000g離心力,離心15分鐘,棄上清,保留沉淀。

                    5、加入C試劑,蛋白酶抑制劑,使用渦旋振蕩器重懸沉淀,分裝-80°C保存

                    6、線粒體測定:蛋白質濃度,OXPHOS活性,Western Blot

                    三、關鍵試劑和儀器

                    1、試劑A 50ml

                    2、試劑B 50ml

                    3、試劑C 10ml

                    4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)

                    5、渦旋混合器VORTEX3000

                    6、低溫高速離心機BIOCEN 22R
                     

                    四、存儲條件

                    試劑A/B/C, 4°C存儲
                     

                    五、其他試劑和儀器

                     

                    1、雙蒸水

                    2、蛋白酶抑制劑(PI)

                    3、BCA蛋白質分析

                    4、2ml離心管

                    5、天平等實驗室常規設備

                     

                    六、操作步驟

                    線粒體制備遵循三個簡單的步驟:細胞破裂,離心去除雜質和大的細胞器,離心分離線粒體。 以下是從培養的人類細胞中制備線粒體的指導原則。 試劑和樣品應盡可能冷藏。 建議使用4 x 150 mm的融合細胞平板(約4x107個細胞)。

                    1、收集細胞:在貼壁細胞的情況下,它們可以用細胞提取器收集,并通過在1000g離心沉淀。 每個平板通常產生2mg全細胞蛋白質。 這可通過蛋白質測定來檢查。

                    2、使用凍融發弱化細胞膜

                    3、按照5mg蛋白加入1ml試劑A量進行計算,在2ml離心管中重懸細胞

                    4、冰上放置10min


                    損壞細胞膜:

                    5、將細胞轉入預冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.

                    6、使用LOOSE杵,勻漿30次

                    7、轉移勻漿液到2ml離心管中.

                     

                    SPIN 1:

                    8、 4°C溫度下1000g離心力,離心10分鐘

                    9、收集上清液#1.

                    10、加入試劑 B 重懸沉淀,加入體積與第3步等同.

                    11、重復損壞細胞膜和 SPIN1中的 第8步.

                    12、收集上清液,記作(SN) #2,丟棄沉淀

                    13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml離心管中,如果超過2ml 請均分到兩個離心管中

                     

                    SPIN 2:

                    14、4°C溫度下12,000g離心力,離心15分鐘

                    15、棄上清,保留沉淀

                    16、使用500μl試劑C,重懸沉淀,同時加入蛋白酶抑制劑

                    17、分裝-80°C保存備用.

                     

                    七、常見問題分析

                     問題

                     可能引起原因

                     解決方法

                     線粒體離心沉淀很少

                     沒有充分將細胞破碎

                     增加勻漿次數

                     大量的細胞色素C

                     細胞過度溶解/細胞不新鮮

                     減少勻漿次數/選取新鮮細胞

                     線粒體純度低

                     存在污染

                     降低SPIN2離心力到6000g

                    杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer

                    VORTEX3000

                    低溫高速離心機BIOCEN 22R

                     

                    附錄一(參考 ab110171 ):

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